輔酶ⅠNAD（H）含量測(cè)試盒 常量可見分光光度法 說明 技術(shù) 文章
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輔酶ⅠNAD(H)含量試劑盒
商品貨號(hào)：QS1000
英文名稱：NAD(H) Kit
別名：輔酶Ⅰ含量測(cè)定試劑盒 NAD(H) Kit 輔酶ⅠNAD(H)含量測(cè)定試劑盒 輔酶ⅠNAD(H)含量測(cè)試盒
檢測(cè)方法：常量法
| 商品貨號(hào)： | 商品品牌： | 規(guī)格 | 基本售價(jià) | 選擇規(guī)格 |
|---|---|---|---|---|
| QS1000-50管/24樣 | 50管/24樣 | ￥500.00元 |
- 產(chǎn)品詳細(xì)介紹
- 產(chǎn)品說明書
測(cè)定意義：
輔酶ⅠNAD(H)廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，NAD+是糖酵解（EMP）和三羧酸循環(huán)（TCA）的主要?dú)涫荏w，生成的NADH經(jīng)呼吸電子鏈（ETC）傳遞把電子交給氧，在合成ATP的同時(shí)，形成大量的ROS，同時(shí)NADH再生為NAD+。糖、脂、蛋白質(zhì)三大代謝物質(zhì)分解中的氧化反應(yīng)絕大部分通過這一體系完成。NAD(H)含量和NADH/NAD+比值的高低可用于評(píng)價(jià)糖酵解和TCA循環(huán)的強(qiáng)弱。較高的NAD(H)及NADH/NAD+比值說明細(xì)胞呼吸耗氧量較高，處于過氧化狀態(tài)。此外，NADH/NAD+比值升高也可抑制糖酵解和TCA循環(huán)。另外，NAD+降解產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、代謝和基因表達(dá)等具有重要的調(diào)控作用。
測(cè)定原理：
分別用酸性和堿性提取液提取樣品中NAD+和NADH，NADH通過PMS的遞氫作用，還原氧化型噻唑藍(lán)（MTT）為甲瓚，在570nm下檢測(cè)吸光值；而NAD+可被乙醇脫氫酶還原為NADH，進(jìn)一步采用MTT還原法檢測(cè)。
貨號(hào)：QS1000 規(guī)格：50管/24樣
輔酶ⅠNAD(H)含量試劑盒說明書
可見分光光度法
正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定
測(cè)定意義：
輔酶ⅠNAD(H)廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，NAD+是糖酵解（EMP）和三羧酸循環(huán)（TCA）的主要?dú)涫荏w，生成的NADH經(jīng)呼吸電子鏈（ETC）傳遞把電子交給氧，在合成ATP的同時(shí)，形成大量的ROS，同時(shí)NADH再生為NAD+。糖、脂、蛋白質(zhì)三大代謝物質(zhì)分解中的氧化反應(yīng)絕大部分通過這一體系完成。NAD(H)含量和NADH/NAD+比值的高低可用于評(píng)價(jià)糖酵解和TCA循環(huán)的強(qiáng)弱。較高的NAD(H)及NADH/NAD+比值說明細(xì)胞呼吸耗氧量較高，處于過氧化狀態(tài)。此外，NADH/NAD+比值升高也可抑制糖酵解和TCA循環(huán)。另外，NAD+降解產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、代謝和基因表達(dá)等具有重要的調(diào)控作用。
測(cè)定原理：
分別用酸性和堿性提取液提取樣品中NAD+和NADH，NADH通過PMS的遞氫作用，還原氧化型噻唑藍(lán)（MTT）為甲瓚，在570nm下檢測(cè)吸光值；而NAD+可被乙醇脫氫酶還原為NADH，進(jìn)一步采用MTT還原法檢測(cè)。
自備的實(shí)驗(yàn)用品及儀器：
可見分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、移液器、1 mL玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。
試劑的組成和配制：
酸性提取液：液體50mL×1瓶，4℃保存；
堿性提取液：液體50mL×1瓶，4℃保存；
試劑一：液體15 mL×1瓶，4℃保存；
試劑二：液體4 mL×1瓶，4℃保存；
試劑三：粉劑×1瓶，-20 ℃避光保存，用時(shí)加入4mL蒸餾水，混勻，用不完的試劑4℃
保存一周；
試劑四：粉劑×1瓶，4 ℃避光保存，用時(shí)加入4mL蒸餾水，混勻，用不完的試劑4℃保
存一周；
試劑五：液體1.8mL×1支，4 ℃保存；
試劑六：液體30mL×1瓶，4 ℃保存；
試劑七：液體50mL×1瓶，4 ℃保存。
NAD+和NADH的提取：
1 血清（漿）中NAD+和NADH的提取
NAD+的提取：按照血清（漿）體積（mL）：酸性提取液體積（mL）為1：5~10的比例（建議取約0.1mL血清（漿），加入1mL酸性提取液），95℃水浴5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心10min；取500μL上清液，加入500μL堿性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。
NADH的提?。喊凑昭澹{）體積（mL）：堿性提取液體積（mL）為1：5~10的比例（建議取約0.1mL血清（漿），加入1mL堿性提取液），95℃水浴5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心10min；取500μL上清液，加入500μL酸性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。
2組織中NAD+和NADH的提?。?/span>
NAD+的提?。喊凑战M織質(zhì)量（g）：酸性提取液體積（mL）為1：5~10的比例（建議取約0.1g組織，加入1mL酸性提取液），冰浴研磨，95℃水浴5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心10min；取500μL上清液，加入500μL堿性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。
NADH的提取：按照組織質(zhì)量（g）：堿性提取液體積（mL）為1：5~10的比例（建議取約0.1g組織，加入1mL堿性提取液），冰浴研磨，95℃水浴5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心10min；取500μL上清液，加入500μL酸性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。
3 細(xì)胞或細(xì)菌中NAD+和NADH的提?。?/span>
NAD+的提?。合仁占?xì)胞或細(xì)菌到離心管內(nèi)，棄上清，按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：酸性提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL酸性提取液），超聲波破碎（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次），95℃水浴5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心10min；取500μL上清液，加入500μL堿性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。
NADH的提?。合仁占?xì)胞或細(xì)菌到離心管內(nèi)，棄上清，按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：堿性提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL堿性提取液），超聲波破碎（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次），95℃水浴5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心10min；取500μL上清液，加入500μL酸性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。
測(cè)定步驟：
- 分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至570nm，蒸餾水調(diào)零。
- 加樣表(在1.5mL棕色EP管中按下表依次加樣）：
試劑名稱(μL) | 對(duì)照管 | 測(cè)定管 |
樣本 | 50 | 50 |
試劑一 | 250 | 250 |
試劑二 | 75 | 75 |
試劑三 | 75 | 75 |
試劑四 | 75 | 75 |
試劑五 | 35 | 35 |
試劑六 | 500 | 混勻，室溫避光靜置20min |
試劑六 |
| 500 |
充分混勻，靜置5min后，20000g，25℃離心5min，棄上清，沉淀中加入：
試劑七 | 1000 | 1000 |
混勻，570nm下比色，讀取對(duì)照吸光值A(chǔ)1和測(cè)定管吸光值A(chǔ)2，計(jì)算△A=A2-A1。
注意事項(xiàng)：
1、如果一次性測(cè)定樣本數(shù)較多，可將試劑一、二、三和四按比例配成混合液。
2、對(duì)照管和測(cè)定管的測(cè)定步驟的區(qū)別：對(duì)照管加完試劑一、二、三、四和五后必須馬上加試劑六；測(cè)定管加完試劑一、二、三、四和五后必須反應(yīng)20min后再加試劑六。
3、反應(yīng)過程中注意避光。
4、由于每一個(gè)測(cè)定管需要設(shè)一個(gè)對(duì)照管，本試劑盒50管保證測(cè)24個(gè)NAD+或NADH.。
NAD+和NADH含量的計(jì)算：
（一）NAD+含量的計(jì)算
1、血清（漿）中NAD+含量計(jì)算
NAD+含量(nmol/mL）=[ (△A -0.099）×36.1×V1) ]÷(V3×V1÷V2)= 722×(△A -0.099）
2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中NAD+含量計(jì)算
(1)按樣本蛋白濃度計(jì)算
NAD+ (nmol/mg prot）=[ (△A -0.099）×36.1×V1)]÷(V1×Cpr)= 36.1×(△A -0.099）÷Cpr
(2)按樣本鮮重計(jì)算
NAD+ (nmol/g 鮮重）= [ (△A -0.099）×36.1×V1)]÷(W×V1÷V2)= 72.2×(△A -0.099）÷W
(3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算
NAD+ (nmol/104 cell）=[ (△A -0.099）×36.1×V1)]÷(500×V1÷V2)=0.1444×(△A -0.099）
（二）NADH含量的計(jì)算
1、血清（漿）中NADH含量計(jì)算
NADH含量(nmol/mL）= [ (△A -0.065）×24.7×V1) ]÷(V3×V1÷V2)= 494×(△A -0.065）
2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中NADH含量計(jì)算
(1)按樣本蛋白濃度計(jì)算
NADH (nmol/mg prot）= [ (△A -0.065）×24.7×V1) ]÷(V1×Cpr)= 24.7×(△A -0.065）÷Cpr
(2)按樣本鮮重計(jì)算
NADH (nmol/g 鮮重）= [ (△A -0.065）×24.7×V1) ]÷(W×V1÷V2)= 49.4×(△A -0.065）÷W
(3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算
NADH (nmol/104 cell）= [ (△A -0.065）×24.7×V1) ]÷(500×V1÷V2)=0.0988×(△A -0.065）
V1：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.05mL；V2：加入提取液體積，2mL；V3：加入血清（漿）體積：0.1mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL； W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500萬。
注意：低檢測(cè)限為1nmol/mL或1nmol/g鮮重 或0.01nmol/mg prot
| 輔酶Ⅰ系列 | ||||
| QS1000 | 輔酶ⅠNAD(H)含量測(cè)試盒 | 可見分光光度法 | 50管/24樣 | 500 |
| MS1000 | 輔酶ⅠNAD(H)含量測(cè)試盒 | 微量法 | 100管/48樣 | 920 |
| QS1001 | 乳酸脫氫酶（LDH）測(cè)試盒 | 可見分光光度法 | 50管/24樣 | 170 |
| MS1001 | 乳酸脫氫酶（LDH）測(cè)試盒 | 微量法 | 100管/48樣 | 330 |
| QS1002 | NAD-蘋果酸脫氫酶（NAD-MDH）測(cè)試盒 | 紫外分光光度法 | 50管/48樣 | 280 |
| MS1002 | NAD-蘋果酸脫氫酶（NAD-MDH）測(cè)試盒 | 微量法 | 100管/96樣 | 550 |
| QS1003 | NADP-蘋果酸脫氫酶（NADP-MDH）測(cè)試盒 | 紫外分光光度法 | 50管/48樣 | 320 |
| MS1003 | NADP-蘋果酸脫氫酶（NADP-MDH）測(cè)試盒 | 微量法 | 100管/96樣 | 600 |
| QS1004 | NADH氧化酶（NOX）測(cè)試盒 | 可見分光光度法 | 50管/48樣 | 450 |
| MS1004 | NADH氧化酶（NOX）測(cè)試盒 | 微量法 | 100管/96樣 | 850 |
| QS1005-50 | 檸檬酸合酶(CS）測(cè)試盒 | 可見分光光度法 | 50管/48樣 | 3200 |
| QS1005-25 | 檸檬酸合酶(CS）測(cè)試盒 | 可見分光光度法 | 25管/24樣 | 2000 |
| MS1005 | 檸檬酸合酶(CS）測(cè)試盒 | 微量法 | 100管/48樣 | 3500 |
| QS1006 | 丙酮酸脫羧酶（PDC）測(cè)試盒 | 紫外分光光度法 | 50管/48樣 | 720 |
| MS1006 | 丙酮酸脫羧酶（PDC）測(cè)試盒 | 微量法 | 100管/96樣 | 1400 |
| QS1007 | 醇脫氫酶（ADH）測(cè)試盒 | 紫外分光光度法 | 50管/48樣 | 280 |
| MS1007 | 醇脫氫酶（ADH）測(cè)試盒 | 微量法 | 100管/96樣 | 550 |
| QS1008 | 單脫氫抗壞血酸還原酶（MDHAR）測(cè)試盒 | 紫外分光光度法 | 50管/48樣 | 800 |
| MS1008 | 單脫氫抗壞血酸還原酶（MDHAR）測(cè)試盒 | 微量法 | 100管/96樣 | 1550 |
| QS1009 | 乙醛脫氫酶（ALDH）測(cè)試盒 | 紫外分光光度法 | 50管/48樣 | 420 |
| MS1009 | 乙醛脫氫酶（ALDH）測(cè)試盒 | 微量法 | 100管/96樣 | 800 |
| QS1010 | NAD激酶（NADK）測(cè)試盒 | 可見分光光度法 | 50管/48樣 | 600 |
| MS1010 | NAD激酶（NADK）測(cè)試盒 | 微量法 | 100管/48樣 | 1100 |
| QS1011 | 線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ/NADH-輔酶Q還原酶測(cè)試盒 | 紫外分光光度法 | 25管/24樣 | 1280 |
| MS1011 | 線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ/NADH-輔酶Q還原酶測(cè)試盒 | 微量法 | 100管/96樣 | 2500 |